Nieuwe, omkeerbare CRISPR-techniek controleert expressie van genen en laat DNA ongemoeid

"Het grote nieuws is dat we nu een eenvoudig instrument hebben dat de grote meerderheid van de genen kan stilleggen", zei Jonathan Weissman. "We kunnen dit doen voor meerdere genen tegelijkertijd zonder enige schade aan het DNA, met een grote mate van homogeniteit en op een manier die teruggedraaid kan worden. Het is een fantastisch instrument om de expressie van genen te controleren." 

Weissman is een biologieprofessor aan het Massachusetts Institute of Technology (MIT), een onderzoeker aan het Howard Hughes Medical Institute, lid van het Whitehead Institute for Biomedical Research en een van de corresponderende auteurs van de studie over de nieuwe gentechnologie. 

Genexpressie wil zeggen dat een bepaald gen in werking treedt en bijvoorbeeld de instructies doorgeeft voor het aanmaken van een eiwit.  

Het klassieke CRISPR-Cas9 systeem gebruikt een eiwit, Cas9, om in het DNA te knippen. Dat eiwit is afkomstig uit het immuunsysteem van bacteriën die het gebruiken tegen virussen. Het systeem kan gericht worden op bepaalde genen in menselijke cellen, waar het Cas9-eiwit dan kleine onderbrekingen in de DNA-strengen maakt. Vervolgens herstelt het bestaande herstelmechanisme van de cel de gaatjes.  

Omdat deze methode het onderliggende DNA verandert, zijn de veranderingen permanent. Bovendien maakt het feit dat ze vertrouwt op de herstelmechanismen van de cel, het moeilijk om het resultaat te beperken tot één enkele, gewilde verandering. "Hoe mooi CRISPR-Cas9 ook is, het laat het herstel over aan natuurlijke cellulaire processen, die complex zijn en veel facetten hebben. Het is erg moeilijk om het resultaat onder controle te houden", zei Weissman. 

En dus zagen de onderzoekers hier een gelegenheid voor een ander soort van genetische technologie, een die niet de DNA-sequentie zelf veranderde, maar de manier waarop het DNA wordt afgelezen in de cel. 

Dit soort van wijziging is wat wetenschappers 'epigenetisch' noemen - genen kunnen stilgelegd of geactiveerd worden door chemische veranderingen rond de DNA-streng. Problemen met de epigenetica van de cel zijn verantwoordelijk voor veel menselijke ziekten zoals het fragiele-X-syndroom en een aantal kankers, en ze kunnen doorgegeven worden aan de volgende generaties.  

Het epigenetisch stilleggen van genen gebeurt vaak door methylering - het toevoegen van een chemisch label op bepaalde plaatsen op de DNA-streng, in het geval van methylering een methylgroep, een koolstofatoom dat gebonden is aan drie waterstofatomen.   

Die methylering maakt dat het DNA niet meer toegankelijk is voor RNA polymerase, het enzyme dat de genetische informatie in de DNA-sequentie leest en omzet in messenger RNA (mRNA), dat dan weer de blauwdruk kan vormen voor eiwitten. 

Professor Weissman en zijn medewerkers hadden eerder al twee andere epigenetische instrumenten voor genbewerking gecreëerd, CRISPRi en CRISPRa,  maar die hadden allebei een groot nadeel. Om CRISPRi en CRISPRa te laten werken in de cellen, moesten die cellen onafgebroken artificiële eiwitten aanmaken om de veranderingen in stand te houden die de epigentische instrumenten hadden aangebracht.

"Met deze nieuwe CRISPRoff technologie kan je een korte tijd een eiwit tot expressie brengen om een programma te schrijven, dat dan vervolgens onbeperkt onthouden en uitgevoerd wordt door de cel", zei Luke Gilbert. "Het is een gamechanger aangezien je nu in essentie een verandering schrijft die doorgegeven wordt bij celdelingen - op een bepaalde manier kunnen we nu leren een versie 2.0 te creëren van CRISPR-Cas9 die veiliger is en net zo effectief." 

Gilbert is hoogleraar aan de University of California San Francisco en naast Weissman de tweede corresponderende auteur van de nieuwe studie. 

Om een epigenetisch instrument voor genbewerking te bouwen dat de natuurlijke DNA-methylering kon nabootsen, creëerden de onderzoekers een piepkleine 'eiwitmachine' die, geleid door RNA's, methylgroepen op bepaalde plekken op de DNA-streng kan plaatsen. Die gemethyleerde genen zijn dan 'tot zwijgen gebracht' of uitgeschakeld, vandaar de naam CRISPRoff. 

Omdat deze methode de sequentie van de DNA-streng niet verandert, kunnen de onderzoekers het effect omkeren door enzymen te gebruiken die de methylgroepen verwijderen, een methode die ze CRISPRon noemen. 

Terwijl ze CRISPRoff aan het testen waren onder verschillende omstandigheden, ontdekten de onderzoekers een aantal interessante kenmerken van het nieuwe systeem. 

Zo bleek bijvoorbeeld dat ze de methode konden richten op de overgrote meerderheid van de genen in het menselijk genoom - en het werkte niet enkel op de genen zelf maar ook op andere regio's van het DNA die de expressie van genen regelen maar niet coderen voor eiwitten. "Dat was zelfs voor ons een geweldige schok, omdat we dachten dat het enkel toepasbaar zou zijn op een subset van genen", zei James Nuñez. 

Nuñez is een postdoctoraal onderzoeker in het laboratorium van Weissman in het Whitehead Institute for Biomedical Research en de eerste auteur van de nieuwe studie. 

Een andere verrassing voor de onderzoekers was het feit dat CRISPRoff zelfs in staat bleek genen uit te schakelen die geen grote gemethyleerde regio's hadden die CpG-eilanden genoemd worden. Tot nu werd gedacht dat die eilanden noodzakelijk waren voor de werking van om het even welk methyleringsmechanisme.   

"Voor we dit onderzoek deden, werd gedacht dat de 30 procent van de genen die geen CpG-eiland hebben, niet gecontroleerd werden door DNA-methylering", zei Gilbert. "Maar ons werk toont duidelijk aan dat je geen CpG-eiland nodig hebt om genen uit te schakelen door methylering. Dat was een grote verrassing voor mij."

Om te onderzoeken welke praktische toepassingen er mogelijk waren voor  CRISPRoff, testten de onderzoekers de methode in geïnduceerde pluripotente stamcellen (induced pluripotent stem cells, iPSC's). Dat zijn cellen die kunnen uitgroeien tot verschillende types van cellen in het lichaam, afhankelijk van de cocktail van moleculen waaraan ze blootgesteld worden. Het zijn dus goede modellen om de ontwikkeling en het functioneren van bepaalde celtypes te bestuderen. 

De onderzoekers kozen een gen uit in de stamcellen dat ze stillegden, en brachten die stamcellen er vervolgens toe zenuwcellen of neuronen te worden. Toen ze in de neuronen naar datzelfde gen gingen kijken, ontdekten ze dat het nog steeds uitgeschakeld was in 90 procent van de cellen. Dat toont aan dat de cellen een herinnering bewaren van de epigenetische wijzigingen, zelfs als ze van celtype veranderen. 

Ze kozen ook een gen uit om te gebruiken als voorbeeld van hoe CRISPRoff gebruikt zou kunnen worden voor therapieën: het gen dat codeert voor het tau-eiwit, dat veel voorkomt in neuronen en dat betrokken is bij de ziekte van Alzheimer. 

Nadat ze hun methode getest hadden bij neuronen, waren ze in staat aan te tonen dat CRISPRoff gebruikt kon worden om de expressie van het tau-eiwit te verminderen, maar dat de methode het gen niet volledig kon uitschakelen. "Wat we getoond hebben is dat dit een doenbare strategie is om tau stil te leggen en de expressie van het eiwit te verhinderen", zei Weissman. "De vraag is nu: hoe dien je dit toe aan een volwassen persoon? En zou het echt voldoende zijn om een impact te hebben op alzheimer? Dat zijn grote open vragen, vooral die laatste." 

Zelfs als CRISPRoff niet leidt tot nieuwe therapieën voor alzheimer, zijn er nog veel andere aandoeningen waarvoor de techniek mogelijk kan toegepast worden. En ook al blijft het toedienen in specifieke weefsels een uitdaging voor gentechnologieën als CRISPRoff, "we hebben aangetoond dat je het tijdelijk kunt toedienen als een DNA of een RNA, met dezelfde technologie die de basis vormt voor de coronavaccins van Moderna en BioNTech", zei Weissman. 

De onderzoekers zijn ook enthousiast over de mogelijkheden van CFRISPRoff voor onderzoek. "Aangezien we nu elk deel van het genoom kunnen stilleggen dat we willen, is het een fantastisch instrument om de functie van het genoom te onderzoeken", zei Weissman. 

Bovendien kan een betrouwbaar systeem om de epigenetica van een cel te wijzigen, onderzoekers helpen om de mechanismen te ontdekken waarmee epigenetische wijzigingen doorgegeven worden over celdelingen heen. "Ik denk dat ons instrument ons echt zal toelaten om de mechanismen van de erfelijkheid te beginnen te bestuderen, vooral van de epigenetische erfelijkheid, wat een enorme onbeantwoorde vraag is in de biomedische wetenschappen", zei Nuñez.

De studie van de onderzoekers van de University of California San Francisco, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical Scool, Stanford University, Whitehead Institute for Biomedical Research, Chan Zuckerberg Biohub en Broad Institute of MIT and Harvard is gepubliceerd in Cell. Dit artikel is gebaseerd op een persbericht van het Whitehead Institute for Biomedical Research.